Utilizzata in epoca dauno-romana come zona sepolcrale (tombe a grotticella) l'area dell'attuale cattedrale era occupata in età tardo antica (VI secolo d.C.) da una grande basilica a tre navate divisa in almeno otto campate, venuta recentemente alla luce. Della preziosa pavimentazione musiva sono rimasti pochi resti.
La struttura paleocristiana presenta forti legami con la coeva architettura cristiana greco bizantina. La ricchezza e le dimensioni dell'edificio sacro sono compatibili solo con una città di un certo rilievo per cui dovrà probabilmente riscriversi parte della storia della città.
Dopo l'abbandono, agli inizi del X secolo, il sito rinacque con la città e vi fu edificata una "seconda" basilica di dimensioni ridotte rispetto a quella paleocristiana. L'attuale cattedrale si eleva sui resti di queste chiese. Essa è costituita da due parti architettonicamente e stilisticamente distinte ma mirabilmente fuse.
Nella cattedrale di Barletta, il 4 febbraio 1459, Ferdinando I d'Aragona fu incoronato sovrano del Regno di Napoli.